Phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian đó người ta không bổ sung thêm chất dinh dưỡng và cũng không loại bỏ sản phẩm cuối cùng của sự trao đổi chất gọi là nuôi cấy tĩnh (quần thể tế bào bị giới hạn trong một khoảng thời gian nhất định). Sự sinh trưởng trong một “hệ thống động” như vậy tuân theo những quy luật bắt buộc [theo các pha lag (pha mở đầu), pha log, pha ổn định và pha tử vong].

Pha ổn định

Trong pha này quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học. Số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Kết quả là số tế bào và cả sinh khối không tăng cũng không giảm.

Nguyên nhân tồn tại của pha ổn định là do sự tích luỹ các sản phẩm độc của trao đổi chất và việc cạn kiệt chất dinh dưỡng.

Sự tăng sinh khối tổng cộng tỷ lệ thuận với nồng độ ban đầu của chất dinh dưỡng hạn chế.

G = K.C

trong đó: G - độ tăng sinh khối tổng cộng;

C - nồng độ ban đầu của chất dinh dưỡng hạn chế;

K - hằng số hiệu suất:

K = G C K = G C size 12{K= { {G} over {C} } } {}

Hằng số hiệu suất K thường được biểu thị bằng số miligam chất khô đối với 1 mg chất dinh dưỡng. Đối với các loại đường, K thường dao động trong khoảng từ 0,20 đến 0,30 nghĩa là từ 100 g đường được tạo thành 20  30 mg khối lượng khô của tế bào. Lượng sinh khối đạt được trong pha ổn định gọi là hiệu suất hoặc sản lượng. Sản lượng phụ thuộc vào tính chất và số lượng các chất dinh dưỡng sử dụng và vào điều kiện nuôi cấy. Đó là sự sai khác giữa số lượng vi khuẩn cực đại và khối lượng vi khuẩn ban đầu (hình 1.9 ):

X = Xmax  Xo

Tỷ lệ sản lượng của tế bào đối với lượng cơ chất tiêu dùng có ý nghĩa rất quan trọng. Nếu biểu thị cả hai đại luợng thành đơn vị khối lượng và sẽ gọi tỷ lệ này (X/S) là hệ số kinh tế (Y). Nếu tính sản lượng ra gam và cơ chất tiêu dùng ra mol thì được gọi là hệ số kinh tế mol (Ym). Nếu biết con đường phân huỷ cơ chất đã cho và hiệu suất ATP do kết quả của sự phân huỷ này, có thể tính được sinh khối vi khuẩn (gam) đối với 1 mol ATP. Ta gọi đó là hệ số năng lượng (YATP).

Hình 1

Trong thực tiển sản xuất cần cung cấp cho vi sinh vật những điều kiện ổn định để trong một thời gian dài chúng vẫn có thể sinh trưởng trong pha log. Dĩ nhiên ở một mức độ nào đó có thể cấy chuyền tế bào nhiều lần vào môi trường dinh dưỡng mới. Đơn giản hơn nên đưa liên tục môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy vi khuẩn đồng thời loại khỏi bình một lượng tương ứng dịch vi khuẩn. Đây chính là cơ sở của phương pháp nuôi cấy liên tục trong các thiết bị nuôi cấy liên tục.

Giả sử có một bình nuôi cấy trong đó vi khuẩn đang sinh trưởng, phát triển. Liên tục bổ sung vào bình môi trường mới có thành phần không đổi. Thể tích bình nuôi cấy không đổi, nghĩa là lượng môi trường được bổ sung cân bằng với lượng môi trường đi ra cùng tốc độ.

Gọi thể tích bình là V (lít), tốc độ dòng môi trường đi vào là f (lít/h) thì tốc độ pha loãng (hệ số pha loãng) D sẽ là f/V. Đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau 1 giờ.

Nếu vi khuẩn không sinh trưởng và phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi bình nuôi cấy với tốc độ:

V − = − dx dt = DX V − = − dx dt = DX size 12{V rSup { size 8{ - {}} } = - { {dx} over {dt} } = ital "DX"} {}

trong đó : X - là sinh khối tế bào, g/l.

Tốc độ sinh trưởng của quần thể vi khuẩn trong bình được biểu diễn bởi phương trình:

V + = dx dt = μX V + = dx dt = μX size 12{V rSup { size 8{+{}} } = { {dx} over {dt} } =μX} {}

Tốc độ thay đổi cuối cùng (tăng hoặc giảm) mật độ vi khuẩn trong nuôi cấy liên tục là sự sai khác giữa tốc độ tăng V+V+ size 12{V rSup { size 8{+{}} } } {}và tốc độ giảm V−V− size 12{V rSup { size 8{ - {}} } } {}:

V = V + − V − = dx dt = μ − D X V = V + − V − = dx dt = μ − D X size 12{V=V rSup { size 8{+{}} } - V rSup { size 8{ - {}} } = { {dx} over {dt} } = left (μ - D right )X} {}

Nếu   D thì giá trị V = dx/dt có giá trị dương, nghĩa là mật độ vi khuẩn trong bình tăng, ngược lại nếu  < D, V sẽ có giá trị âm và mật độ vi khuẩn trong bình giảm. Trong trường hợp đặc biệt  = D, ta có V = 0, nghĩa là mật độ tế bào không tăng không giảm theo thời gian, quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học.

Nếu bình thí nghiệm có thiết bị duy trì sao cho  luôn luôn bằng D, ta sẽ thu được quần thể vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo luỹ thừa thường xuyên ở mật độ tế bào không đổi và không phụ thuộc vào thời gian. Trong trường hợp như vậy không những kích thước trung bình của tế bào mà cả môi trường nuôi cấy đều không đổi và không phụ thuộc vào thời gian. Điều này, một mặt tạo điều kiện cho việc nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý của tế bào vi khuẩn, mặc khác cải thiện quá trình sản xuất sinh khối vi sinh vật ở quy mô công nghiệp.

Nuôi cấy tĩnh được coi như hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng trong đó phải trải qua các pha mở đầu, logarit, ổn định và tử vong. Mỗi pha sinh trưởng được đặc trưng bởi những điều kiện nhất đinh. Việc tự động hoá các pha là khó thực hiện. Nuôi cấy liên tục, trái lại, là hệ thống mở có khuynh hướng dẫn đến việc thiết lập một cân bằng động học. Yếu tố thời gian ở đây, trong phạm vi nhất định, bị loại trừ. Tế bào được cung cấp những điều kiện không đổi, nhờ việc điều chỉnh tự động.

Có thể biểu thị bằng toán học quá trình nuôi cấy liên tục một cách đơn giản như sau:

V ⋅ dx dt = QX o − QX + V − dx dt G V ⋅ dx dt = QX o − QX + V − dx dt G size 12{V cdot left ( { {dx} over {dt} } right )= ital "QX" rSub { size 8{o} } - ital "QX"+V left ( - { {dx} over {dt} } right ) rSub { size 8{G} } } {}

V - thể tích dịch nuôi, l.

Q - hệ số dòng chảy, l/ h.

G - biểu thị tăng trưởng.

V ⋅ dx dt = QS o − QS + V − ds dt C V ⋅ dx dt = QS o − QS + V − ds dt C size 12{V cdot left ( { {dx} over {dt} } right )= ital "QS" rSub { size 8{o} } - ital "QS"+V left ( - { {ds} over {dt} } right ) rSub { size 8{C} } } {}

C - biểu thị tiêu hao.

Bởi vì −dsdtC=−1dxdt⋅1X⋅dxdtX=−1YX/SμX−dsdtC=−1dxdt⋅1X⋅dxdtX=−1YX/SμX size 12{ - left ( { {ds} over {dt} } right ) rSub { size 8{C} } = left ( { { - 1} over { { {dx} over {dt} } } } right ) cdot left ( { {1} over {X} } cdot { {dx} over {dt} } right )X= { { - 1} over {Y rSub { size 8{ {X} slash {S} } } } } μX} {}

Yx/S = g sinh khối/ g cơ chất.

Thay thế vào và coi dsdt=0dsdt=0 size 12{ { {ds} over {dt} } =0} {}, ta có :

Y X / S = dx ds = X S 0 − S Y X / S = dx ds = X S 0 − S size 12{Y rSub { size 8{ {X} slash {S} } } = { {dx} over {ds} } = { {X} over {S rSub { size 8{0} } - S} } } {}

Ở trạng thái ổn định, hiệu suất sinh trưởng có thể biểu đạt bằng lượng sinh khối X và nồng độ cơ chất S. Theo mô hình của Monod thì:

μ = D = μm S K S + S S = K S D μm − D μ = D = μm S K S + S S = K S D μm − D alignl { stack { size 12{μ=D=μm { {S} over {K rSub { size 8{S} } +S} } } {} # S=K rSub { size 8{S} } left ( { {D} over {μm - D} } right ) {} } } {}

Thay thế vào công thức tính YX/S, ta có:

X = Y X / S S o − S = Y X / S S o − K S D μm − D X = Y X / S S o − S = Y X / S S o − K S D μm − D size 12{X=Y rSub { size 8{ {X} slash {S} } } left (S rSub { size 8{o} } - S right )=Y rSub { size 8{ {X} slash {S} } } left [S rSub { size 8{o} } - K rSub { size 8{S} } left ( { {D} over {μm - D} } right ) right ]} {}

Suy ra đơn vị thời gian để thu được sinh khối là:

D x = DY X / S S o − K S D μm − D D x = DY X / S S o − K S D μm − D size 12{D rSub { size 8{x} } = ital "DY" rSub { size 8{ {X} slash {S} } } left [S rSub { size 8{o} } - K rSub { size 8{S} } left ( { {D} over {μm - D} } right ) right ]} {}

Đồng thời có thể biết được lúc:

Dm=μm1−kSkS+SoDm=μm1−kSkS+So size 12{D rSub { size 8{m} } =μm left (1 - sqrt { { {k rSub { size 8{S} } } over {k rSub { size 8{S} } +S rSub { size 8{o} } } } } right )} {} thì DX là sinh khối cực đại.